Transcription par une ARN Polymerase : mesures de forces à l'échelle de la molécule unique
Résumé
We have performed single molecule experiments to
measure the influence of mechanical force on a transcribing T7 RNA polymerase. This motor enzyme is highly processive, and structurally very related to Pol-I family including HIV 1 reverse transcriptase. One end of the template DNA is held by a polymerase anchored to a surface, the other end is attached to a microscopic bead which is captured by an optical trap that measures the force developed during transcription. We report velocity measurements performed with an applied force in the range 5-20 pN, and at different nucleotide concentrations. The nucleotide binding step in the catalytic cycle is limiting when lowering NTP concentration. We observe at low NTP concentration that the velocity of the enzyme becomes markedly force-dependent, whereas it is not at saturant NTP concentration. We deduce that the forward motion of the polymerase along DNA occurs upon nucleotide
binding in the beginning of the reactions cycle. The energy of NTP hydrolysis is thus not directly used as mechanical energy. Homologies among polymerases suggest that translocation mechanism is also shared. Thus we propose that for polymerases in general,
nucleotide binding is associated to forward motion.
We performed another type of single molecule
experiment by measuring the force during the mechanical opening of DNA. It allowed us to determine the rotationnal drag undergone by a rotating DNA molecule.
This DNA unzipping configuration has also been used to study the interaction between EcoR V protein and DNA. The dissociation energy shows a large variability linked to different affinities of the target sites of the enzyme.
measure the influence of mechanical force on a transcribing T7 RNA polymerase. This motor enzyme is highly processive, and structurally very related to Pol-I family including HIV 1 reverse transcriptase. One end of the template DNA is held by a polymerase anchored to a surface, the other end is attached to a microscopic bead which is captured by an optical trap that measures the force developed during transcription. We report velocity measurements performed with an applied force in the range 5-20 pN, and at different nucleotide concentrations. The nucleotide binding step in the catalytic cycle is limiting when lowering NTP concentration. We observe at low NTP concentration that the velocity of the enzyme becomes markedly force-dependent, whereas it is not at saturant NTP concentration. We deduce that the forward motion of the polymerase along DNA occurs upon nucleotide
binding in the beginning of the reactions cycle. The energy of NTP hydrolysis is thus not directly used as mechanical energy. Homologies among polymerases suggest that translocation mechanism is also shared. Thus we propose that for polymerases in general,
nucleotide binding is associated to forward motion.
We performed another type of single molecule
experiment by measuring the force during the mechanical opening of DNA. It allowed us to determine the rotationnal drag undergone by a rotating DNA molecule.
This DNA unzipping configuration has also been used to study the interaction between EcoR V protein and DNA. The dissociation energy shows a large variability linked to different affinities of the target sites of the enzyme.
Nous avons réalisé une expérience à l'échelle de la molécule unique pour étudier l'influence d'une force mécanique sur la transcription par l'ARN polymérase du phage T7. Cette enzyme, prototype de moteur moléculaire, est très processive et partage des homologies avec les membres de la famille Pol I incluant la transcriptase inverse du VIH 1. Une extrémité de l'ADN à transcrire est tenue par une polymérase fixée sur une surface, l'autre extrémité est attachée à une bille microscopique capturée à l'aide d'un piège optique interférométrique qui permet de mesurer la force développée durant la transcription. Des mesures de vitesse de transcription ont été réalisées dans la gamme 5-20 pN, à différentes concentrations en nucléotides (NTP). On observe que la diminution de la concentration en NTP, qui rend l'étape de liaison du nucléotide dans le site actif limitante, fait apparaître une dépendance marquée de la vitesse à la force, alors que les hautes concentrations en NTP rendent la polymérase insensible à la force. On en déduit que le mouvement d'avancée de l'enzyme le long de l'ADN est couplé à la fixation du nucléotide dans le site actif. Ainsi l'énergie d'hydrolyse n'est pas directement convertie en énergie mécanique. Les homologies entre polymérases suggèrent que ce mécanisme est également partagé, ce qui permet de proposer que pour les polymérases en général, l'étape de fixation du nucléotide dans le site actif est couplé au mouvement sur l'ADN.
Nous avons également mené un autre type d'expérience en mesurant la force lors de l'ouverture mécanique de la double hélice d'ADN, qui a permis de déterminer la friction exercée sur l'ADN en rotation.
La configuration d'ouverture de l'ADN a été également utilisée pour étudier l'interaction d'une protéine, EcoR V avec l'ADN. L'analyse des résultats a mis en évidence une grande variabilité dans l'énergie de dissociation, liée à des différences d'affinités entre les sites de reconnaissance spécifiques de l'enzyme.
Nous avons également mené un autre type d'expérience en mesurant la force lors de l'ouverture mécanique de la double hélice d'ADN, qui a permis de déterminer la friction exercée sur l'ADN en rotation.
La configuration d'ouverture de l'ADN a été également utilisée pour étudier l'interaction d'une protéine, EcoR V avec l'ADN. L'analyse des résultats a mis en évidence une grande variabilité dans l'énergie de dissociation, liée à des différences d'affinités entre les sites de reconnaissance spécifiques de l'enzyme.